Extracto
El virus del papiloma humano (VPH), es un virus DNA asociado con la mayoría de los cánceres humanos. Por eso hay un gran interés en descubrir nuevas soluciones, como las vacunas y microbicidas, para prevenir infecciones con este virus. Desarrollando el entendimiento de los últimos requerimientos del ciclo infeccioso de la vida del virus del papiloma. El ciclo de vida infeccioso del virus esta muy ligado con la infección del estado de diferenciación de las primeras células de epitelio, con progenia de los virus sólo en la última etapa diferenciada del compartimiento suprabasal. Hace tiempo se reconoció que el virus primero debe contagiar a la capa de las células basales del epitelio, pero el por qué en este caso aún no se sabe. En parte esta restricción debería reflejar especificidad de los receptores que entran. De cualquier modo, estas hipótesis no explican del todo la restricción en la diferenciación de la infección del VPH.
Muchos tipos de células pueden ser infectadas con VPH en el cultivo de una capa celular. Aquí, usamos el estudio superficial de los sistemas químico biológicamente para revelar que el progreso del ciclo celular a través de la mitosis es crítico para la infección del VPH. Usando partículas infecciosas VPH16 que contengan el genoma virus intacto, queratinocitos humanos sincronizados en G1- como huéspedes, y la temprana expresión genética viral como una lectura de infección, y aprendimos que el recipiente celular debe entrar a mitosis para que la infección del VPH pueda entrar a la última fase inhibitoria de la mitosis no tiene efecto en la infección, mientras que en G1, S, G2 y la etapa temprana de la mitosis el ciclo celular, inhiben eficientemente previniendo la infección.
Concluimos que las células huésped necesitan pasar tempranamente a profase para lograr la transcripción de los genes encapsulados del VPH. Estos descubrimientos nos lleva a una razón de por qué el VPH comienza estableciéndose en el compartimiento basal del epitelio estratificado. Sólo este compartimiento de epitelio contiene células progresando a través del ciclo celular, y es sólo en estas células que el VPH puede establecer su infección. Mediante la definición de la condición de la mayoría de las células susceptibles a la infección del VPH, estos resultados tendrían un importante potencial en las implicaciones que tiene el control del VPH.
INTRODUCCIÓN.
Los virus del papiloma son pequeños, no están envueltos, y poseen doble hebra de ADN viral, que infecta el cutis y/o la mucosa del epitelio en varios vertebrados. Alrededor de 100 genotipos de VPH están categorizados como de alto riesgo (VPH16 y VPH18), o de bajo riesgo (VPH6 y VPH11), dependiendo de su oncogenecidad. Los genotipos de alto riesgo son generalmente asociados con canceres anogenital, incluyendo casi un 100% de los cánceres cervicales, la segunda causa de muerte más frecuente en mujeres con cáncer. El VPH está también asociado al 25% de los canceres de cabeza y cuello, el cáncer numero 6 más frecuente en los Estados unidos.
El ciclo de vida del VPH está intimamente ligado a la diferenciación de sus células epiteliales huésped. Este complejo de vida célula, la cual sólo ocurre en la división de las células basales del epitelio estratificad; b) mantenimiento del ADN viral como una copia de bajo número en la división de las células epiteliales basales; y c) alto número de copias de ADN, amplificación y encapsulación en la parte donde no hay división, y en la diferenciación final de las células epiteliales para producir progenie viral. Los genes tempranos del VPH son expresados a través de este ciclo de vida, mientras que los genes tardíos encapsulados L1 y L2 están solamente expresados en la sección terminal de las células epiteliales diferenciadas. Los mecanismos que controlan este ciclo de vida, particularmente la restricción de la infección del VPH y el establecimiento del ADN en las células basales en división, no se sabe ciertamente.
La cercana relación entre la diferenciación del queratinocito y el ciclo de vida del VPH ha creado una larga escala de producción de infecciones maduras de difíciles partículas de VPH, satisfactoriamente restringe los estudios del mecanismo natural de la infección del VPH [8,9]. Recientemente se han desarrollados métodos de transfección que generan largos rendimientos de las partículas de los virus y la encapsulación efectiva del objetivo de los plasmidios tanto en largo como en longitud, 8 kb. El genoma del VPH ha superado este límite [10,11].
Esta técnica provee una genética modificable, fuente de alto rendimiento de la infección VPH y VPH pseudovirus expresando genes reporteros para estudios de los diferentes pasos de la infección VPH incluyendo virión vinculante, endocitosis, pérdida de la envoltura de la cápside del virión, la liberación del tráfico endosoma, al núcleo, la entrega del ADN de un virus al núcleo, y la transcripción de los genes encapsulados. Para definir los caminos y mecanismos envueltos en estos pasos tempranos de la infección, probamos cerca de 5.000 componentes bioactivos con mecanismos de acción conocidos para efectos en la entrada de las cápsulas de VPH que contienen genes reporteros o el genoma completo del VPH, e identificar un conjunto de inhibidores del ciclo celular que bloqueen completamente el tipo salvaje de la infección del VPH. Nuestros meticulosos estudios mostraron que el progreso del ciclo celular en las etapas tempranas de la mitosis es crítico para que entre la infección del VPH. Estos descubrimientos revelan nuevos conocimientos dentro del mecanismo mediante el cual el VPH infecta células y provee una razón por qué el VPH infecta sólo a células proliferantes indiferenciadas. Estos resultados también proporcionan nuevas pistas para el desarrollo preventivo y estrategias terapéuticas contra la infección del VPH
Resultados
RESUMEN DEL AUTOR
Los papilomas virus humanos (VPH), los cuales comprenden mas de 100 genotipos, es la infección más transmitida sexualmente, y está asociada con múltiples cánceres, incluyendo todos los cánceres cervicales, muchos anogenital cánceres, y el 25% de los cánceres de cabeza y cuello. El ciclo de vida del VPH está intimamente ligado con la diferenciación del epitelio de los queratinocitos de la piel, con la infección inicial ocurriendo sólo en el compartimiento basal indiferenciada del epitelio y el virus procrea sólo en la zona diferenciada terminal del compartimiento suprabasal. Hasta el momento, poco es conocido hacerca de cómo las células huésped restringen el ciclo de vida del VPH a etapas específicas del desarrollo de la piel celular.
Aquí, mediante la identificación de pequeñas moléculas inhibitorias de la infección del VPH, descubrimos que el progreso del ciclo celular a través de la mitosis es crítico para el establecimiento de la infección del VPH. Además, el promover una disección química genética de este proceso, mostró que las etapas tempranas de a mitosis son requeridas por el VPH y la expresión de genes temprana. Nuestros descubrimientos proveen una razón por qué el VPH infecta sólo a células indeferenciadas, celulas proliferando. Estos resultados también proporcionan nuevas pistas para el desarrollo preventivo y estrategias terapéuticas contra la infección del VPH
El adelantamiento del ciclo celular a través de la mitosis es crítica para la infección del VPH.
Para definir que etapa(s) del ciclo celular es crítica para la infección del VPH, sincronizamos célula HaCaT con afidicolina o etopósido y después controlamos firmemente el consiguiente progreso del ciclo celular. En el primer set de experimentos (indicado como “no inhibición; figuras 3A y 3B), células HaCaT fueron sincronizadas en fase G1 con un tratamiento de 24 horas de afidicolina, inoculando con viriones VPHwpA-RL, 4 horas después, liberadas quitando la afidicolina del medio de cultivo. Después de 48 horas de incubación, las células HaCaT infectadas mostraron altos niveles de RL. El nivel de expresión de genes reporteros bajo condiciones de control positivo “no inhibido” fueron fijadas al 100% de infección y usadas para normalizar el nivel de expresión de genes tempranos desde las otras condiciones experimentales (Fig. 3B). En las segundas (detención de G1, Fig. 3A y 3B) y las terceras condiciones experimentales, las células fueron tratadas con afidicolina o etopósido por 24 horas, después de las cuales fueron agregados los viriones VPHwpA-RL. El ciclo celular fue bloqueado en G1/S y G2 con afidicolina y etopósido respectivamente, y las infección del VPH fue inhibido significativa y constantemente bajo ambas condiciones (Fig. 3ª y 3B). Estas condiciones fueron las mismas que utilizamos en la figura 1, el flujo del análisis citométrico mostrado en la figura 3 confirma un bloqueo efectivo del ciclo celular por las concentraciones de afidicolina y etopósido usadas en la figura 1. En la cuarta condición (la fase del progreso S; Fig. A y B), sincronizamos las células en las fases G1/S gracias a un tratamiento de 24 horas de afidicolina, luego añadimos los viriones VPHwpA-RL, 4 horas después reemplazamos la afidicolina con etopósido, el ciclo celular desde la detención en G1 a través de la fase S hasta una detención en G2, permitiéndonos probar si es que la progresión de la fase S favorece la infección del gen reportero en G1/S ni G2 detenido por afidicolina y etopósido (Fig. 3A y 3B). En la quinta condición (progreso de las fases S y M; Fig. 3A y 3B), después de 24 horas sincronizadas y luego de la adición de los viriones VPHwpA-RL, el ciclo celular se dejó progresar libremente por 20 horas, seguido por la detención del ciclo celular en fase G2 con etopósido, permitiendo a las células progresar a través de una ronda completa del ciclo celular, incluida la fase M. Interesantemente una ronda de la progresión de la fase M fue suficiente para una infección del VPH y la expresión del gen (Fig. 3A y 3B). Estos experimentos que le siguieron usamos los viriones del tipo salvaje VPH16 confirmamos que en una ronda de un ciclo celular a través de la mitosis es crítica en las etapas tempranas de la infección de VPH. Conforme a esta premisa, los niveles de expresión del gen del VPH se reforzaron cuando el ciclo celular fue liberado progresivamente por periodos más largos en la detención de G2, alcanzando eventualmente niveles más altos que en el control en condiciones de “no detención” (Fig. 4). Esto sugiere que una detención en G2 seguida de un ciclo celular completo podría proveer una mejor célula huésped para la expresión viral una vez que el virus ha entrado en el núcleo.
Profase temprana, pero no la profase tardía ni metafase, es crítica para la infección temprana del VPH.
Para definir más profundamente las etapas de la mitosis y funciones celulares asociadas que están o no requeridas para sustentar la temprana infección de VPH, nosotros probamos con monastrol (15), que inhibe la formación de huso mitótico durante la profase tardía y metafase en la mitosis temprana y media. Interesantemente, el monastrol, que indujo a detener el ciclo celular en M como esperábamos (Fig. 5B) mostró un efecto no inhibitorio en la infección del VPH en células HaCaT (Fig. 5A). En concentraciones verdaderamente altas de monastrol, hubo un leve pero reproducible aumento en la inefectividad del VPH. Así la infección del VPH puede surgir efectivamente en células inhibidas en profase/metafase tardía. Estos resultados, tomados juntos con aquellas de la figura 3 redujeron la etapa crítica del ciclo celular para la infección del VPH probablemente en la profase temprana. Los eventos celulares en profase temprana incluyen el rompimiento de la membrana nuclear y cambios en la estructura de la cromatina. La fosforilación de los componentes de la membrana nuclear gracias a CDK1 es crítica para estos eventos en la profase temprana (16-18). Examinar si entra en profase temprana es crítico para la infección del VPH, probamos la infección VPHSEAP en células 293T tratadas con el inhibidor CDK1, “Purvalanol A” (19). Purvalanol A inhibe la infección del VPH dosificado específicamente, con 12 µM ambas detienen significativamente el ciclo celular en fase G2/M e inhibiendo la infección del VPH ~ pliegue-5 (Fig. 6A y 6B). Estos resultados implican que el/los evento(s) celulares durante la profase temprana son críticos para la infección del VPH.
La distribución del genoma del virus de la influenza vía poros nucleares no es afectado por los inhibidores del ciclo celular que bloquean la infección del VPH.
La proteína cápside menor del VPH, L2 tiene señales de localización nuclear y, en consecuencia, se ha supuesto que la L2 importa directamente el ADN del VPH a través de poros nucleares durante la infección (20). Un virus que se ha establecido bien para importar su genoma dentro de núcleos intactos vía poros nucleares es un virus influenza (21, 22). Para probar si el VPH y el virus de la influenza tienen mecanismos similares de entrada, nosotros tratamos células 293T en paralelo con un virus influenza con recombinación expresado en “renilla luciferina” o “renilla luciferina-expresada” de pseudoviriones de VPH, en presencia y ausencia de etopósido y afidicolina. Mientras el etopósido y la afidicolina bloquean eficientemente la infección del VPH, como antes, ellos no afectaron significativamente a la infección del virus de la influenza (Fig. .7A), mostrando que sus efectos en el VPH no podrían explicarse por efectos de la importación vía poros nucleares. Nosotros además observamos en células HaCaT la misma diferencia en la dependencia del ciclo celular cuando aquellas células fueron detenidas por hambre de suero e inoculadas con la misma “renilla luciferina-expresada” pseudoviriones de VPH o recombinando virus de la influenza. Bajo estas condiciones (Fig. 7B), la infección del VPH fue inhibida sobre 50 pliegues mientras la infección del virus de la influenza fue solo reducido aproximadamente “2- pliegue”, probablemente debido a la supresión general del metabolismo celular contra el hambre de suero.
Fuente:
http://www.plospathogens.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.ppat.1000318
El uso de analgésicos leves como el paracetamol, la aspirina y el ibuprofeno durante el embarazo sería responsable de una parte del drástico incremento en los desórdenes reproductivos registrados en las últimas décadas, reveló un estudio publicado el lunes.La investigación halló que las mujeres que consumían una combinación de más de un analgésico leve durante la gestación presentaban un mayor riesgo de dar a luz a varones con testículos no descendidos.
